起死回生？CD28双抗+CD3双抗=CAR-T？
Blinatumomab（CD19xCD3）双特异抗体的成功引领了双特异抗体的开发热潮，目前在开发的双特异抗体中，超过一半的抗体是通过CD3激活T细胞，利用T细胞对靶细胞进行杀伤进而达到治疗疾病的目的。
虽然这类双特异抗体在免疫治疗中占据重要的地位，但是一些交叉性研究表明，与CAR-T细胞疗法相比，CD3桥接型双特异抗体在疗效上还是有一定的差距。
图1 信号1和信号2介导的免疫突触激活T细胞
与CAR-T细胞疗法相比，双特异抗体具有耐受良好（CRS相对较低）和通用性等优点，因此如何对双特异抗体改造，在不损害现有优势的条件下提高其疗效是双特异抗体研究的一个方向。
本文章作者是通过引入第二个可以结合CD28的双特异抗体增强CD3双特异抗体的疗效，其中CD3双特异抗体主要是通过“信号1”激活T细胞，而CD28双特异抗体是主要是通过“信号2”增强T细胞的治疗效果。
图2 TSAxCD3和TSAxCD28双特异抗体激活T细胞的机制示意图
TSAxCD28双特异抗体双特异抗体发挥作用需要TSAxCD28和TSAxCD3双特异抗体同时结合到靶标细胞和T细胞上，并形成免疫突触。
为了检测这两个双特异抗体是否可以在靶标细胞和T细胞之间形成免疫突触并发挥作用，作者构建了表达人CD20/PSMA的293细胞株作为靶标细胞，同时构建了CD20xCD3 和PSMAxCD28双特异抗体。
免疫荧光实验表明，仅存在靶细胞或者T细胞的情况下，双特异抗体可以结合细胞并均匀的分布在细胞表面（图3A和3B），当T细胞和靶标细胞同时存在时，两种双特异抗体都可以介导免疫突触的形成（图3C）。
与单独用药相比，两个双特异抗体的联合使用可以强力的促进T细胞的增值（图3D和3E）。
图3 双抗介导的免疫突触
不同靶点的双特异抗体（PSMA和MUC16）在不同的肿瘤细胞上（前列腺癌细胞C4-2细胞表达PSMA抗原；卵巢癌细胞PEO-1表达MUC16）的杀伤效果证明，当TSAxCD28双特异抗体和TSAxCD3抗体联用时，TSAxCD3对肿瘤细胞的杀伤效果很大程度的提高（图4B和4G）——PSAMxCD28使PSMAxCD3的EC50较低了约50倍；MUC16xCD28使MUC16xCD3的最大杀伤效果从40%提高到了80%。
TSAxCD28除了提升CD3相关双抗对肿瘤细胞的杀伤外，还提高了IFN-γ的释放和CD4、CD8T细胞的活性和增值（图4C-4E和4H-4J）。
图4 TSAxCD28增加TSAxCD3双特异抗体的抗肿瘤活性
TSAxCD28在体内增强TSAxCD3双特异抗体的抑制肿瘤活性
在免疫缺陷型小鼠肿瘤模型上，虽然MUC16xCD3单独使用可以在很大程度上抑制肿瘤的生长，但是其无法完全清除肿瘤，但是MUC16xCD28和MUC16xCD3联用基本上可以完全清除肿瘤，并于这种清除是持久的。
而作为的对照的EGFRvIIIxCD3和EGFRvIIIxCD3+ MUC16xCD28却完全无法一种肿瘤的生长（图5A和5B）。治疗后，MUC16xCD28和MUC16xCD3联用组小鼠在肿瘤抗原负荷上也显著低于其它抗体治疗组（图5C）。
同样，在表达人CD3/CD28和相关肿瘤抗原的人源化小鼠模型中，TSAxCD28双特异抗体和TSAxCD3抗体联用比两者单独使用有更强的抗肿瘤活性。
而且，联用可以促使T细胞释放更多的IFN-γ和IL-2（图6A-6F）。
图5 MUC16xCD28在NGS模型肿瘤模型中增强MUC16xCD3双特异抗体抗肿瘤活性
图6 TSAxCD28双抗在人源化小鼠模型中增强TSAxCD3双特异抗体抗肿瘤活性
利用FDA推荐的干、湿固定实验方法检测CD28相关抗体对T细胞的激活，本研究的所用的双特异抗体（PSMAxCD28,MUC16xCD28和它们的母抗体）都无法促进T细胞的增值，而作为对照的阳性抗体CD28-SA（2价CD28超级机动性单抗）和CD3单抗却可以很大程度的促进T细胞的增值。
猴子实验中，TSAxCD28双特异抗体单独使用也无法促使IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10等细胞因子的释放，而CD28-SA可以促进相关细胞因子的释放（图7C-7G），这证明，TSAxCD28的单独使用安全可控。
图7 TSAxCD28双特异抗体对T细胞的激活
CD3相关双特异抗体在血液肿瘤治疗中已经取得了巨大成功，但是在实体瘤领域其治疗效果差强人意，因此还有许多地方需要改善，如增强其肿瘤杀伤效果，减少CRS等相关副作用等。
在增强抗T细胞活性方面，人们很早就意识到，通过TCR复合物（信号1）激活的T细胞可以在共刺激分子（如CD28等）的作用下增强对肿瘤细胞等的清除能力。
但是早期的技术的落后以及2006年TGN1412临床事故导致了CD28相关激动型抗体研究的终止。
随着抗体技术的进步以及对CRS等相关副作用认识的进一步加深，CD28相关抗体又逐渐进入人们的视野。
再生元构建了TASxCD28双特异抗体，这些抗体不同于早期的CD28超级激动型抗体，它们不仅可以介导信号2相关的免疫突触的形成，而且在单独使用时不会系统性的激活T细胞，因此更加安全。
当与TSAxCD3双特异抗体联用时，其可以很大程度的提高CD3相关双特异抗体的疗效，并且可以增加肿瘤中记忆性T细胞和激活型T细胞。
TSAxCD28双特异抗体和TSAxCD3抗体联不仅可以通过CD3激活信号1而且还可以通过CD28激活信号2，这在功能上类似于CAT-T细胞疗法的作用（CAR-T通过包内的CD3ζ激活T细胞，并通过包内的CD28等相关共刺激分子促进T细胞的增值和作用效果）。
但是与CAR-T相比，双特异抗体联用更有优势，首先，抗体制备更容易并且为通用型，其次当两个双抗识别的肿瘤抗原不同时（TSA1xCD28，TSA2xCD3），只有同一个靶标细胞上有两种抗原，才能最大程度的激活T细胞的作用，从而降低双抗的脱靶效应。
该研究让我们对CD28相关抗体的作用有了新的认识，也许不久的将来，CD28抗体将会起死回生！
参考文献
1、Dimitris Skokos*, Janelle C. Waite, Lauric Haber et al. A class of costimulatory CD28-bispecific antibodies that enhance the antitumor activity of CD3-bispecific antibodies. Science Translational Medicine 2021.
2、Jonathan H. Esensten,1,* Ynes A. Helou,2 Gaurav Chopra. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity 2016.
3、R. Stebbings, D. Eastwood, S. Poole, and R. Thorpe. After TGN1412: Recent developments in cytokine release assays. Journal of Immunotoxicology 2013.
BiG专栏作者
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